Cromatografía fase líquida

Cromatografía fase líquida

La cromatografía fase líquida (LC), por sus siglas en inglés, se caracteriza, porque como su nombre lo indica, la fase móvil que se utiliza es líquida. Es una técnica que se usa para separar los componentes de una mezcla que consiste en dos fases. Principalmente, está indicada para la separación de compuestos orgánicos semivolátiles.

Pero, ¿cuál es el origen de la cromatografía líquida?

A principios del siglo XX comenzó su historia. Todo se dio cuando el científico británico, Mikhail Tswett quiso separar una cantidad de pigmentos vegetales. El experto, procedió así a inyectar el extracto de la planta y el éter de petróleo –mezcla líquida de compuestos inflamables- en una columna de vidrio que contenía carbonato de calcio.

En este procedimiento, Tswett observó a través de la columna de vidrio los cambios que iba realizando la muestra que en principio solo evidenciaba una capa de pigmento. Sin embargo, tiempo después, el pigmento se separó en cuatro colores diferentes: verde azulado, verde amarillento, amarillo y naranja.

En vista que el proceso tardó varias horas, se dio cuenta que no era del todo práctico y no fue hasta 1970, es decir medio siglo después del descubrimiento de este científico, que la HPLC se convirtió en una herramienta popular.

¿Qué significa HPLC?

HPLC quiere decir, Cromatografía Líquida de Alta Resolución. En los años 70 la venta de instrumentos HPLC promovió su uso en áreas de análisis práctico. Cabe resaltar que cromatografía fase líquida por su parte, representa a toda la cromatografía líquida, incluyendo LC de baja presión, pese a esto LC se utiliza como comparable a HPLC.

También existe la UHPLC, que es Cromatografía Líquida de Ultra Alto Rendimiento. En  este tipo de tecnología se usa una partícula menor que conlleva mayor eficiencia, a su vez se separa más rápido con una mayor resolución y sensibilidad.

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¿Cómo se usa la cromatografía líquida?

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En palabras resumidas, se usa para identificar, cuantificar y purificar los componentes de una mezcla. Como un dato curioso, esta metodología se aplica para detectar sustancias prohibidas en atletas, por ejemplo.

Sin embargo, tiene una alta gama de aplicaciones en diferentes campos como lo con: la bioquímica, química analítica, productos farmacéuticos, ciencia forense e investigación alimentaria. Los expertos recomiendan utilizar la cromatografía líquida por su versatilidad y asequibilidad.

Tipos de cromatografía líquida (LC)

Existen varios tipos de LC:

Cromatografía de partición: que es la técnica de separación de moléculas basada en su diferente solubilidad entre dos fases inmiscibles; lo que quiere decir que dos fluidos o sustancias no tienen la capacidad de constituir una solución homogénea.

En esta aplicación, la fase estacionaria es revestida con una fase solvente y la mezcla por separar, se pasa a través de la fase móvil.

Cromatografía de adsorción: en esta etapa se realiza la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido, donde queda limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Cabe destacar que la retención puede ser química o física.

Cromatografía Iónica: en este proceso se separan iones y moléculas polares basadas en las propiedades de carga de las moléculas. Es empleada mayormente en la purificación de proteínas, análisis del agua, o control de calidad.

Cromatografía de exclusión: en esta técnica analítica, se separan macromoléculas disueltas en su elusión desde columnas que contengan un gel poroso.

Métodos para el desarrollo de HPLC

Existen ciertos pasos que hay que cumplir para desarrollar un método de cromatografía líquida:

Se debe definir los objetivos de la separación, es decir conocer información sobre la muestra

Aplicar el procedimiento de cromatografía líquida

Elegir el detector adecuado en conjunto con sus condiciones

Tener en cuenta la elección del método LC y estimar posteriormente cuál es o cuáles son las mejores condiciones de separación

Optimizar las condiciones de separación

Estar al pendiente de cuáles problemas se pueden presentar al realizar los procedimientos

Validar si el método es el adecuado para su uso rutinario

Componentes de la HPLC

La cromatografía líquida se da gracias a los siguientes sistemas:

Inyector

Es ubicado junto  a la bomba. Como método más sencillo se aplica usando una jeringa donde la muestra se introduce en el flujo de la fase móvil. Es clave el diseño del inyector porque la precisión de la medición de la cromatografía fase líquida es afectada en gran medida por cuánto se reproduzca la inyección de la muestra.

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Columna

La separación en esta aplicación se da dentro de una columna. Es decir, es casi el corazón del sistema de cromatografía en fase líquida. En la actualidad, las columnas son preparadas con acero inoxidable, que vienen a sustituir las columnas de vidrios usadas por muchos años. Cabe destacar que se usó esta sustitución, debido a que el acero inoxidable es tolerante a gran cantidad de disolventes.

Detector

El detector es utilizado para observar la separación que se llegue a obtener. Su función es medir las diferencias entre la presencia de analito y la composición del eluyente. ¿Cómo se realiza?, a través de una señal electrónica.

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Grabador

Este elemento es de vital importancia para proporcionar las características de los datos adquiridos en el proceso, es decir, el pico de ajuste, corrección de línea de base, cálculo de concentración automática, determinación de peso molecular, entre otros.

Degaseador

Debido a que el eluyente que es usado para el análisis de LC puede contener gases que no podemos ver porque son “invisibles” para nuestros ojos, este se detecta por un ruido que provoca una línea base inestable. Por eso se usa un desgasificador que mediante tubos elimina los gases.

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Calentador de columna

La temperatura que tenga la columna influye en gran medida la separación de LC, es por ello que las columnas permanecen durante el proceso dentro del horno o calentador de columna.

Aplicaciones de la cromatografía líquida

La cromatografía líquida tiene varios campos de aplicación:

Se usa en fármacos: esta técnica es usada para la creación o activación de antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos, etc.

En la bioquímica se usa en aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos.

También es útil en productos de alimentación como: edulcorantes artificiales, antioxidantes, anflatoxinas y aditivos.

Es usado en productos de la industria química como por ejemplo: aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores y colorantes.

En contaminantes fenoles, pesticidas, herbicidas, entre otros.

Es útil en la medicina clínica y en química forense: drogas, venenos, alcohol en sangre, y también para determinar ácidos bilares, metabolitos de drogas, estrógenos y extractos de orina.

Pero también la HPLC es utilizada en aplicaciones para: separación y purificación de metabolitos; separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de orina; purificación de compuestos naturales y más.

Tipos de detectores

Los detectores empleados en la cromatografía líquida o HPLC, están adaptados y diseñados con el fin de perfeccionar e incorporar las celdas de flujo que permiten medir las concentraciones de analito en una muestra.

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Si bien, hay varios tipos de detectores, hablaremos de los más usados:

Detector UV

En este tipo de detector el flujo de líquido que proviene de la columna, pasa a través de una celda pequeña con el fin de minimizar el ensanchamiento de banda. El cromatograma está constituido por la medida de absorbancia del líquido que la atraviesa.

Para realizar este proceso es necesario utilizar: un fotómetro de filtro; que es el detector de absorción UV más simple y está empleado por una lámpara de mercurio como fuente y una serie de filtros con la cual se mide la absorbancia.

A su vez, se usa un espectrómetro de barrido; el cual permite realizar el análisis. ¿Cómo se hace?, seleccionando una o varias (según convenga) longitudes de onda en el lugar de interés.

Por último un espectrómetro de arreglos de diodos; para registrar la totalidad del espectro proporcionando así, un cromatograma tridimensional que muestra: absorbancia según intervalos mínimos de tiempo.

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Detector de fluorescencia

Cabe destacar que este tipo de detectores son muy sensibles. Están basados en la capacidad de algunos solutos que permiten emitir fluorescencia, o incluso, de aquellos que no pueden hacerlo por sí solos, pero sí a través de un proceso llamado derivatización.

Entre los más sencillos se encuentran los que emplean una fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros que permitan aislar la radiación fluorescente.

Detector de dispersión de luz

Cabe destacar que este detector, responde a todos los solutos menos volátiles que la fase móvil y tiene un límite de detección entre 0.1 y 1ng.

El proceso de este método se produce mediante la interacción de la radiación electromagnética con la materia y un complejo proceso que finaliza en la vaporización de la fase móvil, que deja unas finas gotitas de soluto sin evaporar.

Detector electroquímico: son detectores que responden a analitos susceptibles a oxidarse o reducirse.

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Detector electroquímico

Son detectores que responden a analitos susceptibles a oxidarse o reducirse.

Detector de conductividad

Trabajan mediante los cambios de conductividad de la fase móvil en presencia de moléculas de analito. Este tipo de detectores está formado por una celda asilada que contiene: dos electrodos. Sobre ellos, se aplica una diferencia de potencial para medir la resistencia que ofrece la mezcla eludida.

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Detector acoplado a espectrómetro de masas

Trabaja mediante interfaces como termovaporizador; que vaporiza el eluato y forma un aerosol de moléculas de disolvente y analito. Una interfase de ionización química a presión atmosférica, que mediante una calefacción, más el uso de nitrógeno, convierte el eluato en el aerosol que evapora el disolvente y finalmente, una interfase de ionización de electronebulización; donde el eluato atraviesa un capilar metálico aplicando en la salida, un campo eléctrico y una corriente coaxial de nitrógeno gaseoso para crear un fino aerosol de partículas cargadas.

¿Sabías que el agua contaminada puede afectar la cromatografía líquida?

La HPLC puede ser afectada debido a contaminantes presentes en el agua y aquí te los destacamos:

La contaminación por compuestos orgánicos es quizás una de las más comunes y puede afectar el resultado de la cromatografía líquida de diferentes maneras.

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Vida útil de la columna: debido a que las moléculas orgánicas que están vinculadas a la superficie de la columna pueden desacelerar el acceso a las moléculas de muestra y sus solventes en la fase estacionaria. Esto, conlleva a que disminuya la capacidad de la columna para realizar el proceso de separación  de compuestos o pérdida de resolución y por ende, una menor vida útil de la columna.

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Datos no precisos: si se acumulan compuestos orgánicos en el cabezal de la columna y luego se recogen como eluyente, puede darse la obtención de picos fantasmas.

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Reduce la sensibilidad: las moléculas orgánicas en el agua podrían llegar a competir con las moléculas de la muestra, lo que produciría que estas últimas se vinculen con la columna, y por consiguiente se reduzca el número de moléculas liberadas en el proceso de elución.

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Que cambie el tiempo de retención, también es una consecuencia de la presencia de contaminantes en el agua. Los altos niveles de compuestos orgánicos pueden crear una fase estacionaria en la columna que produzca cambios en el tiempo de retención y por consecuencia, colas en los picos.

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Filtraciones de los medios de purificación, tubos y recipientes y contaminación bacteriana.

Es importante destacar que, la presencia de partículas y coloides en la muestra de agua, también pueden provocar daños en la bomba y el inyector; incluso, la columna puede verse obstruida. Por otra parte, si hay iones presentes en el disolvente, afectan también las separaciones cromatográficas.

¿Sabías que?: La prueba de anti doping para atletas se hace con Cromatografía fase líquida

En el control de anti doping para atletas es usada esta técnica de cromatografía líquida. Para analizar las muestras, es necesario una medición de:

Orina: donde se mide el consumo reciente, de 3 a 5 días. Recordemos que la mayoría de sustancias prohibidas detectadas se sitúa alrededor de las 48 horas, exceptuando la marihuana y el cannabis que puede ser detectado incluso 28 días después.

Saliva: se puede detectar hasta tres días posteriores al consumo de cualquier sustancia. Es menos invasiva que las pruebas de orina pero la mayoría de sustancias no puede ser detectada en la saliva al cumplir el plazo ya mencionado.

Cabello: esta mide el consumo de drogas crónicas o a largo plazo. El procedimiento se realiza con alrededor de 50 milímetros de cabello que mayormente son de la cabeza, pechos, axilas o también de la zona púbica. En los Juegos Olímpicos, por ejemplo, realizan esta prueba, una vez que el examen de orina haya dado positivo.

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